Los anticuerpos contra las proteínas nativas de Mycobacterium tuberculosis pueden detectar pacientes con tuberculosis pulmonar

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12685 (2023) Citar este artículo

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Las pruebas precisas en el lugar de atención (POCT) son fundamentales para el tratamiento de la tuberculosis (TB). Sin embargo, el diagnóstico actual basado en anticuerpos muestra baja especificidad y sensibilidad. Para encontrar candidatos a antígenos adecuados para el diagnóstico de tuberculosis mediante anticuerpos, evaluamos la capacidad de respuesta de las IgG a las proteínas de Mycobacterium tuberculosis en pacientes con tuberculosis pulmonar (PTB). Empleamos proteínas secretadas importantes, como Rv1860, Ag85C, PstS1, Rv2878c, Ag85B y Rv1926c que se purificaron directamente de M. tuberculosis. En la primera evaluación, encontramos que los niveles de IgG estaban significativamente elevados en pacientes con PTB solo frente a Rv1860, PstS1 y Ag85B entre los antígenos analizados. Sin embargo, PstS1 y Ag85B recombinantes de Escherichia coli (E. coli) no pudieron distinguir a los pacientes con PTB de los controles sanos (HC). El Rv1860 recombinante no fue comprobado debido a su poca expresión. Luego, a los 59 pacientes con PTB confirmados del Hospital Académico General Soetomo, Surabaya, Indonesia, y a 102 HC se les realizaron pruebas de Rv1860 y Ag85B solo debido al bajo rendimiento de PstS1 de M. tuberculosis. El análisis ROC utilizando Ag85B y Rv1860 nativos mostró un área bajo la curva aceptable para el diagnóstico, que es 0,812 (IC del 95%: 0,734–0,890, p <0,0001) y 0,821 (IC del 95%: 0,752–0,890, p <0,0001). Este estudio indica que tener en cuenta la estructura de la proteína nativa es clave en el desarrollo del POCT de la tuberculosis mediante un diagnóstico basado en anticuerpos.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa con alta incidencia, prevalencia y mortalidad. A nivel mundial, hubo 10,6 millones de casos de tuberculosis en 2021. Además, en 2021, hubo 1,6 millones de muertes, incluidos pacientes con tuberculosis comórbidos con VIH/SIDA. La cifra de mortalidad entre las personas VIH negativas fue de aproximadamente 1,4 millones, mientras que la de las personas VIH positivas fue de 187.0001,2,3. Ese mismo año, también se informó que los 30 países con mayor carga de tuberculosis son principalmente países en desarrollo, que representaron el 87% de los nuevos casos de tuberculosis a nivel mundial3. Según esos datos, la tuberculosis sigue siendo un gran problema de salud en el mundo. En los países donde la tuberculosis es endémica se demandan pruebas de tuberculosis precisas pero baratas y sencillas en el lugar de atención para controlar esta enfermedad mortal a nivel mundial.

La sensibilidad y especificidad de las herramientas de diagnóstico comerciales previamente establecidas son cuestionables debido a sus resultados inconsistentes en el diagnóstico de la tuberculosis. Además, el método de diagnóstico de tuberculosis reciente tiene algunas limitaciones. El cultivo de M. tuberculosis en el sistema Löwenstein-Jensen (LJ) o BACTEC™ MGIT™ 960 requiere mucho tiempo, mientras que las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) como GeneXpert MTB/RIF son costosas. Además, la OMS (2015) no recomienda el uso de la prueba cutánea de la tuberculina (TST) ni del ensayo de liberación de interferón gamma (IGRA) para diagnosticar la tuberculosis activa. Además, IGRA y TST no pueden predecir el riesgo de progresión de la tuberculosis de un individuo4,5. Sin embargo, la respuesta inmune de los pacientes con tuberculosis pulmonar (PTB) tiene el potencial de rastrear la progresión de la enfermedad de tuberculosis.

Estudios anteriores sugieren que una persona asintomática produce anticuerpos contra los antígenos de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) en pequeñas cantidades. Por el contrario, los pacientes con tuberculosis activa presentan títulos de anticuerpos aumentados5,6,7. Por lo tanto, la detección del perfil de respuesta inmune de los pacientes contra los antígenos de M. tuberculosis es una forma razonable de diagnosticar tanto la tuberculosis activa como la progresión de la tuberculosis a partir de una infección tuberculosa latente (LTBI).

Las infecciones bacterianas pueden activar la inmunidad celular y la secreción de anticuerpos por parte de las células plasmáticas para combatir la infección. Datos anteriores mostraron que los pacientes con PTB tienen títulos elevados de inmunoglobulinas séricas contra antígenos micobacterianos; sólo alrededor del 10% no mostró ningún aumento8,9. Sin embargo, las pruebas serológicas desarrolladas anteriormente proporcionaron resultados inconsistentes con valores de sensibilidad y especificidad muy variables. En consecuencia, no se han recomendado las pruebas de serodiagnóstico disponibles comercialmente para detectar la tuberculosis3,4.

Mientras tanto, los anticuerpos se pueden utilizar para diagnosticar la mayoría de las enfermedades infecciosas. Además, la detección de la respuesta de anticuerpos se puede realizar de forma rápida y sencilla a bajo coste. Esto lo hace potencialmente útil en países con una alta carga de tuberculosis si es sensible y preciso. IGRA, que detecta respuestas celulares, es engorroso, requiere mucho tiempo y es costoso, y su uso es limitado en países con una alta carga de tuberculosis. Además, se ilustró que la proporción de personas con una prueba IGRA positiva que desarrollaron la enfermedad durante el seguimiento fue inferior al 10%3. Por tanto, es necesario saber por qué la detección de anticuerpos, que se supone que se producen explícitamente contra patógenos, no se utiliza para un diagnóstico preciso de la tuberculosis.

Se sabe que las proteínas secretadas son inmunodominantes ya que interactúan directamente con las células inmunes sin alteración bacteriana. En este estudio, evaluamos las respuestas de anticuerpos contra las principales proteínas secretadas purificadas de M. tuberculosis, como Rv1860, Ag85C, PstS1, Rv2878c, Ag85B y Rv1926c, en pacientes con PTB del Hospital Académico General Soetomo, Surabaya, Indonesia. Elegimos centrarnos en estas proteínas porque se caracterizan como proteínas secretoras importantes, altamente inmunogénicas o son componentes inmunoestimuladores de la membrana celular de las micobacterias. Encontramos la importancia de utilizar proteínas nativas de M. tuberculosis en el diagnóstico de tuberculosis basado en anticuerpos.

Se adquirieron cincuenta y nueve muestras de suero del grupo clínicamente positivo, prueba bacteriológica positiva [C (+) –B (+)] y 102 muestras de suero del grupo HC (Fig. 1). La mayoría de los pacientes del grupo C (+) –B (+) tenían entre 55 y 64 años (29%). En este estudio, hubo más pacientes mujeres que tenían un mayor porcentaje de infecciones por tuberculosis que pacientes masculinos. Alrededor del 61% de los pacientes del grupo C (+) –B (+) fueron casos nuevos. Además, alrededor del 25% de los pacientes en el grupo C (+) –B (+) tenían neumonía adquirida en la comunidad (CAP) como comorbilidad (Tabla 1).

Diagrama de flujo del diseño del estudio y categorización de la muestra.

Purificamos proteínas secretadas como Rv1860, Ag85C, PstS1, Rv2878c, Ag85B, Rv1926c y derivados proteicos purificados (PPD) de filtrados de cultivos de M. tuberculosis, y probamos su reconocimiento por IgG de sueros de PTB mediante ELISA. Utilizamos PPD como control ya que representa los filtrados totales de cultivo inactivados por calor de M. tuberculosis. Como estudio preliminar, se realizó una detección en sueros de 30 pacientes con PTB de 59 pacientes con PTB del Hospital Académico General de Soetomo, y un número igual de HC de 102 HC. Los niveles de anticuerpos IgG del grupo de pacientes contra PPD, Rv1860, PstS1, Ag85B y Ag85C fueron significativamente más altos que los del grupo HC. Por el contrario, los títulos de anticuerpos IgG contra los antígenos Rv2878c y Rv1926c no mostraron diferencias significativas entre los pacientes con PTB y los HC (Fig. 2).

Gráfico de la cantidad de IgG en respuesta a (a) control negativo (sin proteína, que contiene PBS 1x), (b) PPD, (c) Rv1860, (d) Ag85C, (e) PstS1, (f) Rv2878c, (g) Ag85B y (h) Rv1926c que indican la concentración de anticuerpos séricos en 30 pacientes con PTB y grupos HC. Los resultados se analizaron individualmente y los datos se presentaron como media ± DE.

El análisis ROC reveló que PPD, Rv1860, Ag85B, PstS1 y Ag85C tenían un valor de AUC aceptable entre siete antígenos (Figura complementaria S1). Por el contrario, Rv2878c y Rv1926c tuvieron un valor de AUC bajo (Tabla 2). La sensibilidad de la respuesta de los anticuerpos IgG a los siete antígenos osciló entre el 53,3 y el 83,33%. Además, el valor predictivo positivo (VPP) osciló entre 69,57 y 95%, y el valor predictivo negativo (VPN) osciló entre 62,16 y 84,38%. Los resultados estadísticos mostraron que PPD, PstS1, Ag85B y Rv1860 tienen el potencial de usarse como antígenos para el serodiagnóstico porque mostraron mayor sensibilidad, especificidad, PPV y VPN en comparación con los demás. Aunque Ag85C tiene un valor de AUC aceptable, tiene una sensibilidad baja (Tabla 2). En conjunto, estos datos sugieren que las IgG reconocen algunas, pero no todas, las proteínas en pacientes con PTB activo.

Los niveles inesperados, altamente sensibles y específicos de IgG para PstS1, Ag85B y Rv1860 en pacientes con PTB nos llevaron a comprobar si se pueden observar valores de AUC similares cuando se utilizan proteínas recombinantes producidas por Escherichia coli (E. coli). Expresamos y purificamos ePstS1 y eAg85B recombinantes en E. coli ClearColi® BL21. Sin embargo, Rv1860 no se expresó con éxito, posiblemente debido a la falta de modificación postraduccional en E. coli10. Por tanto, no fue posible su comparación con la proteína nativa. Posteriormente, evaluamos las respuestas de IgG de los 30 pacientes con PTB y HC, de manera similar al experimento de detección de IgG anterior, contra los antígenos PstS1 y Ag85B recombinantes y nativos. El resultado mostró que el título de anticuerpos IgG contra PstS1 y Ag85B nativos era significativamente mayor en pacientes con PTB que en HC. Por el contrario, PstS1 y Ag85B recombinantes no mostraron diferencias significativas entre los dos grupos. (Fig. 3).

Gráfico de la cantidad de IgG en respuesta a (a) control negativo (PBS 1x), (b) ePstS1, (c) PstS1, (d) eAg85B y (e) antígeno Ag85B que indica la concentración de anticuerpos séricos en 30 pacientes con PTB y HC. grupos. Los resultados se analizaron individualmente y los datos se presentaron como media ± DE.

No pudimos distinguir entre pacientes con PTB y HC por los títulos de IgG cuando utilizamos proteínas recombinantes expresadas a partir de E. coli. En el caso de ePstS1, se observaron títulos elevados de IgG en HC. En el caso de Ag85B, eAg85B apenas reaccionó con IgG derivada de sueros de pacientes con PTB. En consecuencia, el análisis ROC muestra que el valor de AUC de PstS1 y Ag85B recombinantes fue menor que el de las proteínas nativas, junto con la sensibilidad, especificidad, PPV y VPN (Tabla 3; Fig. 4). El resultado de esta comparación indicó que la proteína nativa funcionó mejor que las proteínas recombinantes correspondientes.

Curva característica receptor-operador (ROC) de la concentración de IgG de (a) ePstS1, (b) PstS1, (c) eAg85B y (d) antígeno Ag85B entre pacientes con PTB y el grupo de controles sanos.

Este estudio encontró que Rv1860, Ag85B y PstS1 nativos reaccionaban bien con las IgG de pacientes con PTB en las proteínas purificadas analizadas. Continuamos la investigación examinando las IgG contra Ag85B y Rv1860 nativos en un mayor número de sujetos (59 pacientes con PTB y 102 HC). Utilizamos Rv1926c nativo como control para proteínas poco inmunogénicas. Desafortunadamente, excluimos PstS1 debido al bajo rendimiento de la proteína nativa. Descubrimos que la concentración de anticuerpos de clase IgG contra Ag85B y Rv1860 en el grupo C (+) –B (+) fue significativamente mayor que la del grupo HC (P <0,05, Fig. 5). Sin embargo, los anticuerpos contra Rv1926c no mostraron diferencias entre HC y C (+) –B (+) (Tabla 4, Figura complementaria S4).

Gráfico de la cantidad de IgG en respuesta a (a) Ag85B, (b) Rv1860, que indica la concentración de anticuerpos séricos en los grupos clínicamente positivos: prueba de bacteriología positiva [C (+) –B (+)] y HC. Los resultados se analizaron individualmente y los datos se presentaron como media ± DE. La curva característica receptor-operador (ROC) de la concentración de IgG de los antígenos (c) Ag85B y (d) Rv1860 entre el grupo clínicamente positivo (prueba bacteriológica positiva) [C (+)–B (+)] y los controles sanos mostró que ambos antígenos dar un valor aceptable.

El análisis ROC de las tres proteínas mostró que Ag85B y Rv1860 tenían valores de AUC de 0,812 (IC del 95%: 0,734–0,890, p <0,0001) y 0,821 (IC del 95%: 0,752–0,890, p <0,0001) (Tabla 4, Fig. 5). ) respectivamente, que son aceptables para el diagnóstico, mientras que Rv1926c tuvo un valor de AUC bajo (Tabla 4). Según el análisis estadístico, Ag85B y Rv1860 mostraron mayor sensibilidad, especificidad, VPP y VPN que los otros dos antígenos. El valor de sensibilidad de Ag85B y Rv1860 fue de 77,97% y 62,71%, respectivamente. Mientras que la especificidad de Ag85B y Rv1860 fue de alrededor del 82,35% y 93,41%, respectivamente (Tabla 5).

Con base en los datos, se hizo un diagrama de Venn para ilustrar la relación de la cantidad de IgG entre Ag85B y Rv1860 frente a muestras de suero. El diagrama de Venn muestra que en el grupo C (+) –B (+), alrededor de 34 pacientes dieron positivo tanto para Ag85B como para Rv1860 (Fig. 6) y, en combinación, dieron como resultado una sensibilidad del 83 %. Por otro lado, 81 personas del grupo HC dieron negativo para ambos antígenos, lo que resultó en una especificidad combinada del 79,4%.

Diagrama de Venn que compara los conjuntos de datos de Ag85B y Rv1860 en (a) clínicamente positivo: prueba de bacteriología positiva [C (+) –B (+)] y (b) control sano (HC).

Nos gustaría mostrar si la gravedad de la enfermedad de los pacientes afecta su respuesta de anticuerpos. De este modo, comprobamos la correlación entre el nivel de IgG y la gravedad de la enfermedad del sujeto. La clase de gravedad (SC) de los pacientes en este estudio se determinó mediante la puntuación Bandim TB11,12. Esta puntuación observó los signos y síntomas de los pacientes para especificar su clase de gravedad. Los datos mostraron que la mayoría de los pacientes tenían síntomas de tos y disnea, mientras que algunos tenían un IMC inferior a 16 kg/m2 (Tabla 6).

Según los registros médicos, los pacientes C (+) –B (+) fueron ubicados en el grupo más grave. Treinta y tres pacientes C (+) –B (+) se clasificaron en el grupo SC 3 (Tabla 7). Además, Spearman analizó la correlación entre la clase de gravedad y la respuesta de IgG.

Los resultados del análisis de Spearman no mostraron correlación entre la gravedad de la enfermedad y la respuesta de IgG del paciente contra Ag85B y Rv1860 (Tabla 8). Aparte de estos dos antígenos, el análisis estadístico también mostró que la respuesta de IgG contra Rv1926c no se correlaciona con la gravedad del sujeto de investigación (Tabla 9). En conjunto, estos resultados sugieren que el nivel de IgG contra una proteína particular de M. tuberculosis puede ser útil en la detección de la tuberculosis, pero no refleja el estado de la enfermedad de tuberculosis del paciente.

Desarrollar diagnósticos de tuberculosis rápidos y precisos sigue siendo un desafío hoy en día. El estándar de oro para el diagnóstico de tuberculosis, el cultivo basado en LJ, tarda entre cuatro y ocho semanas en obtener resultados13. Mientras tanto, BACTEC™ MGIT™ 960 tarda aproximadamente 14 días, lo que impide el diagnóstico oportuno de la tuberculosis, lo que lo convierte en un desafío en el control de la tuberculosis13. El diagnóstico basado en anticuerpos se utiliza ampliamente para detectar enfermedades infecciosas14,15,16. Podría aplicarse al diagnóstico de tuberculosis debido a su rapidez y simplicidad, especialmente en países con una alta carga de tuberculosis y países de bajos ingresos, si el nivel de sensibilidad y especificidad es de un valor aceptable. Además, la recolección de muestras de sangre para la detección de anticuerpos es más fácil que la recolección de esputo, ya que los pacientes a veces tienen problemas para expectorar el esputo13,14,15,16,17.

Desde hace muchos años se viene informando del desarrollo de diagnósticos basados en la detección de anticuerpos en sueros, pero todavía es necesario seguir investigando. El producto del serodiagnóstico para detectar PTB activo es controvertido debido a la variación de resultados. Sin embargo, algunos estudios previos respaldan los resultados de esta investigación. Varios estudios anteriores demuestran que el serodiagnóstico tiene el potencial de rastrear la progresión de la enfermedad de tuberculosis a partir de una infección asintomática5,8,18,19,20.

Evaluamos los niveles de IgG frente a proteínas secretadas purificadas de M. tuberculosis y confirmamos que algunas proteínas son bien reconocidas por la IgG producida por pacientes con PTB (Figs. 2 y 3). Nuestros resultados mostraron que Ag85B y Rv1860 tenían el valor AUC más alto entre los antígenos analizados. El valor AUC indica la precisión de una prueba de diagnóstico. La curva ROC se considera buena cuando tiene un valor de AUC > 0,8021,22,23,24. Ag85B y Rv1860 también tuvieron los mejores valores de sensibilidad, especificidad, VPN y PPV en comparación con otros antígenos, lo que resalta su uso potencial como objetivos de diagnóstico. El resultado de este estudio confirmó una producción elevada de anticuerpos específicos de antígeno en pacientes con PTB.

Contrariamente a nuestros hallazgos, varios estudios informaron que las proteínas recombinantes dan un resultado como biomarcador para el diagnóstico de tuberculosis 5,18,24,25,26,27. Estos estudios previos demostraron que Ag85B y Rv1860 tienen un uso potencial como biomarcadores en el diagnóstico de la progresión de la tuberculosis. Ag85B está altamente conservado entre otras especies de micobacterias28. Estudios serológicos anteriores sobre reacción en cadena de la polimerasa inmune (I-PCR) demostraron que algunas proteínas como Ag85B, ESAT-6 y factor de cordón contra el PTB junto con la tuberculosis extrapulmonar mostraron resultados positivos29. Además, otras proteínas como CFP-10, CFP-21, MPT-64 y PstS1 se han destacado como objetivos potenciales para I-PCR y I-PCR cuantitativa en tiempo real (RT-I-PCR)30,31. Además, Rv1860 es una proteína secretada bien descrita en M. tuberculosis y que influye en la producción de IFN-γ por las células T CD4+ y CD8+10,32.

Inesperadamente, encontramos que las IgG reconocían mejor las proteínas nativas en comparación con las recombinantes producidas en E. coli, según lo detectado por ELISA (Fig. 4). Estos resultados sugieren la posibilidad de que las modificaciones postraduccionales, que ocurren específicamente en M. tuberculosis, determinen la capacidad de respuesta de las IgG a las proteínas nativas de M. tuberculosis. Se informa que Rv1860 está glicosilado en su treonina en la posición 27, y esta modificación postraduccional fue crítica para reconocer el clon de células T CD8 establecido en un paciente con LTBI10. De manera similar, la O-glicosilación ocurre en PstS1 (antígeno de 38 kDa)33. Se sabe que estas proteínas modificadas postraduccionalmente son altamente inmunogénicas. Se considera que las respuestas inmunes que reconocen modificaciones específicas de especies en las proteínas de los patógenos detectan patógenos con mayor precisión que el reconocimiento de secuencias de proteínas por sí solo y, por lo tanto, pueden conducir a respuestas adecuadas del huésped contra las infecciones. Como tal, el reconocimiento preciso por parte de las respuestas inmunes del huésped también es útil para el desarrollo de métodos de diagnóstico.

Ag85B también se estudia ampliamente como una proteína secretora altamente inmunogénica en M. tuberculosis, pero hasta ahora no se ha informado de su modificación postraduccional. Nuestros datos preliminares mostraron que el Ag85B desnaturalizado todavía posee reactividad con las IgG en pacientes con tuberculosis. Esto sugiere que las IgG específicas de Ag85B no reconocen estructuras tridimensionales, pero reconocen modificaciones postraduccionales indefinidas que ocurren en Ag85B. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que se produzcan modificaciones postraduccionales obstructivas innecesarias en las expresiones expresadas en E. coli. Aunque necesitamos más investigación para determinar la causa exacta de este fenómeno, está claro que tener en cuenta la estructura nativa de las proteínas de M. tuberculosis es clave en el desarrollo del diagnóstico de tuberculosis basado en anticuerpos.

A nivel mundial, Indonesia tuvo la segunda carga de tuberculosis más alta en 2021, con una alta tasa de incidencia total de 354 por 100.000 habitantes3. Se estima que una cuarta parte de la población humana mundial tiene LTBI, la mayor parte de la cual proviene de países endémicos de tuberculosis como Indonesia. Por lo tanto, no fue sorprendente que 102 sujetos sanos evaluados en este estudio incluyeran personas con LTBI.

El nivel de anticuerpos se correlaciona con las cantidades de antígenos; por lo tanto, refleja la progresión y la actividad de la enfermedad. En un estudio reciente, informamos niveles indetectables de IgG contra Ag85B en un elefante diagnosticado con LTBI. Sin embargo, estos niveles aumentaron drásticamente justo antes de la aparición de la tuberculosis, después de la latencia a largo plazo34. Se ha demostrado que el aumento de los niveles de anticuerpos puede potencialmente rastrear la progresión de la enfermedad de tuberculosis en humanos infectados asintomáticos5,18. Como tal, especulamos que el aumento observado en IgG contra Ag85B y Rv1860 entre HC podría indicar un riesgo de desarrollo de tuberculosis en poblaciones de LTBI.

La LTBI es una fuente importante de tuberculosis. El diagnóstico preciso de tuberculosis basado en anticuerpos puede potencialmente detectar no solo enfermedades activas, sino también el riesgo de desarrollo de tuberculosis por LTBI5,18. Como continuación de este estudio, se está considerando un estudio de cohorte longitudinal que investiga los cambios en los niveles de IGRA y anticuerpos entre la población LTBI en Indonesia.

La medición del nivel de gravedad en pacientes con PTB se realizó mediante el método Bandim TB. Intentamos comprobar la correlación entre el nivel de IgG y la gravedad de la enfermedad del paciente con PTB. Según Rudolf12, Bandim TB es un método sencillo que se utiliza en países de ingresos medios y bajos. El método ayuda a monitorear a los pacientes con PTB o MDR-TB que todavía están en el período de medicación y también puede desempeñar un papel en la detección de la enfermedad de tuberculosis12. Esa fue nuestra razón para utilizar este método para determinar el nivel de gravedad en pacientes con PTB. En este estudio, no incluimos la medición de la circunferencia media del brazo (MUAC). El puntaje total de este método fue 13, si se incluyera la medición MUAC, pero cumplió 11 en esta investigación12.

Nuestro estudio evidenció que el nivel de gravedad de la enfermedad del paciente no influye en su respuesta IgG. Un estudio anterior también informó que los métodos de puntuación como KPS, puntuación 1 de Bandim TB y puntuaciones II de Bandim TB no se correlacionan con la enfermedad cavitaria en las radiografías de pulmón35. Por el contrario, Niki et al.18 mostraron una asociación significativa de los niveles de IgA contra HrpA en pacientes con enfermedad activa con estado de inflamación clínica medido por la “proteína C reactiva (PCR) al ingreso”, entendiéndose el ingreso como el punto de diagnóstico antes del tratamiento. Sin embargo, según Niki et al.18, no existe asociación entre los títulos de IgG con el indicador inmunológico y otros indicadores clínicos que comprobaron, como el grado de gravedad basado en el tipo de rayos X (cavidad) y la extensión de los rayos X.

Aún no se ha informado la correlación entre el grado de gravedad determinado por Bandim TB y la respuesta de IgG. Según investigaciones anteriores, se ha demostrado que el estado nutricional es vital en la manifestación clínica de la tuberculosis. La alta incidencia y prevalencia de la tuberculosis se observa más en los países de ingresos medios y bajos que en los países de ingresos altos. Por lo tanto, buscar una relación entre el estado nutricional y los títulos de IgG podría resultar atractivo para futuras investigaciones18.

Hasta la fecha, la OMS todavía desaconseja el uso de pruebas serológicas para el diagnóstico activo de la tuberculosis; sin embargo, alientan a realizar más investigaciones para mejorar su calidad4,26. Por lo tanto, se espera que esta investigación pueda proporcionar información útil sobre la importancia del uso de proteínas nativas para el diagnóstico de tuberculosis basado en anticuerpos. La investigación posterior sobre proteínas nativas específicas de M. tuberculosis, como ESAT-6 y CFP-10, podría resultar valiosa.

Con base en el resultado presentado, deducimos que las pruebas de antígeno combinadas, en lugar de las únicas, podrían ser una estrategia de diagnóstico decente para desarrollar un ensayo de serodiagnóstico que también podría predecir la progresión de la tuberculosis. En el futuro, planeamos comparar la sensibilidad y especificidad entre el serodiagnóstico e IGRA en grupos de tuberculosis activa, infección tuberculosa latente (LTBI) y personas sanas. Además, también se espera que la prueba serológica respalde el diagnóstico de otros tipos de tuberculosis difíciles de diagnosticar, como los casos de tuberculosis prematuros con baciloscopia negativa y tuberculosis extrapulmonar, incluidas la pleuritis tuberculosa y la meningitis tuberculosa. Por lo tanto, podría ser valioso desarrollar investigaciones sobre pruebas serológicas para el diagnóstico de estos tipos de tuberculosis. Además, también es importante completar un examen más detenido de la predicción de la modificación postraduccional de las proteínas en M. tuberculosis.

El presente estudio reveló que la proteína nativa funcionó mejor que la recombinante. Los resultados del examen especificaron que la proteína nativa de M. tuberculosis es esencial como candidato para el diagnóstico de tuberculosis. Los resultados también demostraron que Ag85B y Rv1860 nativos pueden distinguir entre los grupos C (+) –B (+) y HC mejor que otras proteínas.

La población de este estudio incluye 102 pacientes sospechosos de tuberculosis con síntomas clínicos del Hospital Académico General Soetomo, Surabaya, Indonesia. Todos los pacientes fueron examinados con herramientas de diagnóstico de tuberculosis, y 59 pacientes que dieron positivo en la prueba GeneXpert MTB/RIF (Cepheid, EE. UU.)36,37 o/y bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) fueron seleccionados retrospectivamente como clínicamente positivos - prueba de bacteriología positivo [C (+)–B (+)]. Si bien 43 muestras mostraron resultados negativos de GeneXpert MTB/RIF, mostraron resultados radiológicos positivos y exhibieron signos y síntomas positivos de enfermedades de tuberculosis. Las 43 muestras se denominaron pacientes clínicamente positivos - prueba bacteriológica negativa [C (+) –B (-)]. Aunque estos pacientes no cumplieron con los criterios para el diagnóstico bacteriológico, todos tuvieron resultados anormales en el examen de rayos X de tórax que respaldaron resultados positivos para TB. El médico los diagnosticó como pacientes con TB activa y decidió darles tratamiento para la TB38,39. Sin embargo, eliminamos las 43 muestras y nos centramos en 59 del grupo [C (+) –B (+)] (Fig. 1) porque no pudimos probar que fueran TB positivas.

También se recogieron un total de 102 muestras de suero de personas sanas o de control sano (HC), que no mostraban ningún síntoma de tuberculosis (Fig. 1). El rango de edad de HC se comparó con el de los pacientes con sospecha de tuberculosis. Por lo tanto, este estudio es un estudio de casos y controles de edad coincidente. Se realizó una radiografía de tórax a sujetos sanos para confirmar que no padecían la enfermedad de tuberculosis.

Todos los métodos de este estudio se implementaron según las directrices y regulaciones aplicables. Los trabajadores sanitarios del Hospital Académico General Soetomo recogieron todos los sueros utilizados en este estudio siguiendo la Declaración de Helsinki. El comité de ética del Hospital Académico General Soetomo aprobó el estudio con el número de autorización ética 0410/KEPK/VII/2018. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos o de sus tutores legales.

El PPD se adquirió del laboratorio BCG de Japón (Tokio, Japón). Además, purificamos algunas proteínas nativas de M. tuberculosis (Figura complementaria S2). Estas proteínas fueron adquiridas mediante un estudio previo utilizando caldo de cultivo purificado de M. tuberculosis40. Sin embargo, tras un examen más detenido, la tioredoxina y el Rv3803c tenían una concentración baja, por lo que los excluimos de experimentos posteriores.

Los genes que codifican las proteínas PstS1, Ag85B y Rv1860 se amplificaron mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) para su clonación. Para la expresión de Ag85B, PstS1 y Rv1860 con una etiqueta HIS en sus extremos C-terminales, sintetizamos cebadores que contienen 6 × secuencia HIS y sitios de enzimas de restricción (Nde1 y EcoR1), y amplificamos regiones de ADN específicas del ADN genómico de M. tuberculosis. por PCR. Los cebadores utilizados incluyeron Ag85B-HIS directo: 5′-CCCATATGTTCAGCCGTCCGGGTCTGCCGG-3'; Ag85B-HIS reverso: 5′- CCGAATTCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGATGACCCGCACCCAGGCTG-3′; PstS1-HIS adelante: 5′-CCCCATATGGGTTGCGGCAGCAAGCC-3 ′; PstS1-HIS Inversa: 5′-CCGAATTCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCTGCTAATGGTCGCGATCAG-3'; y Rv1860-HIS adelante: 5′-CCCATATGGACCCGGAGCCGGCTCCGCC-3 ′; Rv1860-SU Reverso; 5′-CCGAATTCTATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTCGCCGGCAGGGTACGTTG-3′.

Los ADN amplificados se digirieron con Nde1 y EcoR1, lo que dio como resultado fragmentos de ADN que contenían el gen Ag85B, PstS1 o Rv1860, que se purificaron mediante fraccionamiento con electroforesis en gel seguido de inserción en el mismo sitio en pET22b (+) (Novagen). Después de confirmar la secuencia de ADN de cada vector de expresión mediante el método de Sanger, los vectores de expresión se transformaron en ClearColi® BL21. Los transformantes se cultivaron en 500 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contenía 50 µg/ml de carbenicilina a 37 °C hasta una densidad óptica de 0,5. Para la expresión de proteínas recombinantes, luego se añadió isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM y el cultivo se incubó adicionalmente durante 1 h.

Los cultivos bacterianos se enfriaron inmediatamente en hielo y se recogieron mediante centrifugación a 8000 g durante 10 minutos a 4 °C. Después de retirar el sobrenadante; Los sedimentos bacterianos se suspendieron en Tris-HCl 10 mM y tampón NaCl 300 mM, pH 7,5, y se rompieron mediante sonicación con enfriamiento. Luego, las muestras se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos a 4 °C y se separaron las fracciones solubilizadas y los sedimentos. En este punto, realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y la mayoría de eAg85B y ePstS1 se encontraron en los gránulos. Por otro lado, a pesar de múltiples intentos, no pudimos detectar la expresión de eRv1860 y, por tanto, no pudimos proceder con su purificación.

Los sedimentos, incluidos eAg85B y ePstS1, se solubilizaron en Tris-HCl 10 mM, NaCl 300 mM y urea 6 M y se aplicaron a una columna Ni-NTA mediante His GraviTrap™ (GE Healthcare Amersham Bioscience, Reino Unido) y se purificaron en presencia de Urea 6 M según las instrucciones del fabricante. Luego, la concentración de urea se redujo gradualmente mediante diálisis de 6 a 0 M en el transcurso de una semana para facilitar el replegamiento de las proteínas, y finalmente las muestras se suspendieron en una solución de Tris-HCl 10 mM y NaCl 300 mM. Luego, los ePstS1 y eAg85B purificados se analizaron mediante electroforesis (Figura complementaria S3). Los resultados se validaron mediante espectrometría de masas (Figura complementaria S3).

Se realizó un análisis proteómico para identificar aún más las proteínas nativas purificadas de M. tuberculosis y la proteína recombinante (ePstS1 y eAg85B) de E. coli (Figuras complementarias S2 y S3). La preparación purificada de las proteínas nativas y la proteína recombinante se separó mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida y luego se tiñó con Coomassie Brilliant Blue R250. Cada banda de proteína purificada se cortó, se redujo y se alquiló con ditiotreitol y yodoacetamida respectivamente, y se sometió a digestión con tripsina en gel como se describió anteriormente41,42.

Los digestos de tripsina se disolvieron en ácido fórmico al 0,3%, se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,45 µM (Ultrafree-MC, Millipore) y se analizaron en modo de inyección directa en un sistema de cromatografía líquida de nanoflujo Eksigent NanoLC 415 (AB Sciex, Framingham, MA, EE. UU.) utilizando una columna con punta de pulverización C18 de 75 µm × 150 mm (3 µm, 120 Å, Nikkyo Technos, Tokio, Japón) junto con un espectrómetro de masas en tándem TripleTOF5600 + (AB Sciex).

La fase móvil A era ácido fórmico al 0,1%. Mientras que la fase móvil B era ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. Los péptidos se eluyeron mediante un gradiente de 20 min de 2 % a 32 % de B a 300 nl/min. El espectro de MS y 10 espectros de MS/MS se adquirieron en un modo dependiente de los datos con 1,3 s de tiempo cíclico. El tiempo de exclusión dinámica se fijó en 8 s. La autocalibración se llevó a cabo cada 4 a 5 muestras utilizando 50 fmol de digestión de tripsina de albúmina sérica bovina (BSA) como calibrante (tecnología KYA, Tokio, Japón).

Los datos sin procesar producidos por el software Analyst TF 1.6 (AB Sciex) se convirtieron en archivos genéricos de mascotas mediante MS Data Converter (AB Sciex). Luego se buscó en una base de datos de secuencias de proteínas de Mycobacterium tuberculosis (cepa ATCC25618/H37Rv) descargada de UniProt el 7 de noviembre de 2016, utilizando un motor de búsqueda Mascot (versión 2.6, Matrix Science, Boston, MA, EE. UU.). Las tolerancias de péptidos y MS/MS se establecieron en ± 20 ppm y ± 0,1 Da, respectivamente. Se permitió un máximo de 2 escisiones omitidas. Las modificaciones se establecieron de la siguiente manera: la carbamidometilación de la cisteína fue la modificación fija, mientras que la desamidación de la asparagina o la glutamina, la oxidación de la metionina, la glutamina N-terminal a piroglutamato y el ácido glutámico N-terminal a piroglutamato se incluyeron como modificaciones variables. La tasa de descubrimiento falso (FDR) objetivo se fijó en <1%.

Se utilizó ELISA para determinar la concentración de IgG de pacientes con PTB y HC contra varias proteínas de M. tuberculosis. El antígeno se diluyó en solución salina tampón fosfato (PBS) 1 x pH 7,2 hasta una concentración de 5 μg/ml. Luego se recubrieron las microplacas (Maxisorp, Thermo Scientific Nunc, Dinamarca) con los antígenos durante la noche a 4 °C. Posteriormente, las placas se lavaron con PBS-Tween 20 y luego se bloquearon con leche desnatada al 5 % en PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % durante la noche a 4 °C43.

El siguiente paso fue agregar muestras de suero humano diluidas 1:200 en PBS que contenían 0,05% de Tween 20 y 1% de leche desnatada en placas y se incubaron a 37 °C durante 1 h. Luego, las placas se incubaron durante 1 h con IgG antihumana de cabra Fc-HRP (Southern Biotech, Cat No 2048-05) a una dilución de 1:5.000. A continuación, se agregaron a cada pocillo 100 µl de reserva-TMB de SureBlue (SeraCare, 5120-0083, EE. UU.). Después de una incubación durante 5 minutos en la oscuridad, la reacción se detuvo añadiendo 100 µl de HCl 1 N. La absorbancia se leyó utilizando un lector de absorbancia de microplacas iMark™ (Bio-Rad) a 450 nm43.

Los sujetos con PTB inscritos en este estudio fueron evaluados clínicamente y la gravedad de su enfermedad se clasificó utilizando la puntuación de TB de Bandim modificada. Los criterios de evaluación se basaron en la manifestación clínica de la enfermedad de cinco síntomas (tos, hemoptisis, disnea, dolor torácico y sudoración nocturna) y cinco signos (anemia, pulso > 90 latidos/min, auscultación pulmonar positiva, temperatura corporal > 37° C, índice de masa corporal (IMC) < 18 o < 16 kg/m2). En este estudio no se incluyó el MUAC < 220 o < 200 mm porque los datos no estaban disponibles en el Hospital Académico General Soetomo12,44.

Cada variable vale un punto; específicamente, la variable IMC obtiene un punto adicional si el IMC es inferior a 16 kg/m2, por lo que la puntuación máxima es 11. Hay tres clases de gravedad basadas en la puntuación Bandim TB que se aplicaron en este estudio, a saber: clase leve o clase grave 1 (SC 1) con una puntuación de 0 a 3, clase moderada o clase grave 2 (SC 2) con una puntuación de 4 a 5 y clase grave 3 (SC 3) con una puntuación de 6 a 1111.

Los resultados estadísticos se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney utilizando GraphPad Prism ver. 9.5.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.), y los resultados con p < 0,05 se consideraron significativos. La curva de características operativas del receptor (ROC) y el área bajo la curva (AUC) con IC del 95% para cada antígeno también se calcularon utilizando el mismo software. El índice de Youden determinó la sensibilidad y especificidad de cada antígeno43. El resultado de la respuesta de IgG con la clase de gravedad se correlacionó mediante Spearman mediante SPSS.

Los conjuntos de datos de este estudio están disponibles previa solicitud razonable al autor correspondiente.

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Queremos agradecer a todos los miembros del Departamento de Bacteriología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Niigata. También queremos agradecer al Ministerio de Investigación, Tecnología y Educación Superior de la República de Indonesia. Por último, pero no menos importante, agradecemos al Director del Hospital Académico General Soetomo, Surabaya, Indonesia, y al Presidente del Instituto de Enfermedades Tropicales, Universitas Airlangga, Surabaya, Indonesia.

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación sobre Enfermedades Infecciosas Emergentes y Reemergentes de AMED con el número de subvención JP18fk0108005 y 22fk0108129h0403, MEXT KAKENHI con el número de subvención 21KK0136 de MEXT y el Programa Cooperativo de Ciencias Médicas Estados Unidos-Japón contra la Tuberculosis y la Lepra para Sohkichi Matsumoto. . Además, la subvención número 200/UN3.14/LT/2018 de la Dirección General de Educación Superior, el Ministerio de Tecnología de Investigación y la República de Educación Superior de Indonesia también ayudó en este estudio.

Departamento de Bacteriología, Facultad de Medicina, Universidad de Niigata, Asahimachi-Dori 1-757, Chuo-ku, Niigata, 951-8510, Japón

Desak Nyoman Surya Suameitria Dewi, Kimika Hagino, Tomoya Yamazaki, Yuriko Ozeki, Haruka Kobayashi, Erina Inouchi, Yutaka Yoshida, Satoshi Ishikawa, Amina Kaboso Shaban, Yoshitaka Tateishi, Akihito Nishiyama y Sohkichi Matsumoto

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciputra, CitraLand CBD Boulevard, Made, Kec. Sambikerep, Surabaya, 60219, Indonesia

Nyoman Surya Suameitria Dewi instó

Departamento de Microbiología Médica, Facultad de Medicina, Universidad Airlangga, Jl. Mayor General Profr. Dr. Moestopo 47, Surabaya, 60131, Indonesia

Made Mertaniasih y Sohkichi Matsumoto

Laboratorio de Tuberculosis, Instituto de Enfermedades Tropicales, Universidad Airlangga, Campus C Jl. Mulyorejo, Surabaya, 60115, Indonesia

Ni Made Mertaniasih

Departamento Subneumológico de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad Hang Tuah, Complejo Oeste RSAL Dr. Ramelán, Jl. Gadung No.1, Jagir, Surabaya, 60111, Indonesia

Soedarsono

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Gadjah Mada, Jl. Fauna 2 Karangmalang, Yogyakarta, 55281, Indonesia

Wayan Tunas Artama

One Health/Eco-Health Resource Center, Universidad Gadjah Mada, Jl. Teknika Utara, Barek, Sleman, Yogyakarta, 55281, Indonesia

Wayan Tunas Artama

Zoológico de Fukuyama, 276‑1, Fukuda, Ashida‑cho, Fukuyama, Hiroshima, 720‑1264, Japón

Satoshi Ishikawa

Departamento de Micobacteriología, Centro de Investigación de la Lepra, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Aoba-cho 4-2-1, Higashimurayama-shi, Tokio, 189-0002, Japón

Manabu Ato

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DNSSD, NMM, S. y SM dirigieron el proyecto de investigación, diseñaron el estudio y lo conceptualizaron. DNSSD, NMM, S., KH, TY, YO, WTA, HK, EI, YY, SI, YT, AN, MA y SM prepararon los recursos. DNSSD, HK, EI, YY y SM realizaron experimentos y analizaron los resultados. DNSSD y SM redactaron el manuscrito. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Desak Nyoman Surya Suameitria Dewi, Ni Made Mertaniasih o Sohkichi Matsumoto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Dewi, DNSS, Mertaniasih, NM, Soedarsono et al. Los anticuerpos contra las proteínas nativas de Mycobacterium tuberculosis pueden detectar pacientes con tuberculosis pulmonar. Representante científico 13, 12685 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39436-4

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Recibido: 01 de marzo de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39436-4

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