Desarrollo de RT multiplex cuantitativa.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12073 (2023) Citar este artículo

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La hepatitis Delta es una enfermedad causada por la exposición a los virus de la hepatitis B (VHB) y la hepatitis D (VHD), generalmente con un resultado clínico más grave en comparación con una monoinfección por VHB. Hasta la fecha, la prevalencia real de la infección por VHD está subestimada y los métodos de detección son escasos, especialmente en las regiones más endémicas. Por lo tanto, se desarrolló un método RT-qPCR de un solo paso para la cuantificación del ARN-HDV. Se seleccionaron muestras biológicas entre 2017 y 2023 de pacientes del Ambulatório Especializado em Hepatites Virais del Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia y del Serviço de Assistência Especializada y se les realizó la prueba desarrollada por este estudio y un segundo ensayo cuantitativo RT-qPCR. La pendiente del ensayo cuantitativo inicial fue −3,321 con una eficiencia del 100,04% y un factor de amplificación igual a 2. El análisis de los datos de repetibilidad reveló un Límite de Cuantificación de 5 copias/reacción y un Límite de Detección (95%) de 2,83 copias por reacción. En las pruebas de sensibilidad diagnóstica hubo una precisión del 97,37% en comparación con la prueba de referencia. Este ensayo demostró ser altamente eficiente y reproducible, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para monitorear a los pacientes con hepatitis Delta y evaluar el riesgo de progresión de la enfermedad, así como la efectividad del tratamiento.

El virus de la hepatitis delta (VHD) clasificado en el género Deltavirus es atípico, presenta alrededor de 1.700 nucleótidos de una sola hebra de ARN de polaridad negativa con un tamaño entre 36 y 43 nm y en su estructura externa presenta proteínas de superficie del virus de la hepatitis B (VHB). )1,2. La infección por VHD está precedida por una exposición previa, actual o simultánea a una infección por VHB. Habitualmente su evolución clínica será más grave, caracterizada por una progresión acelerada hacia cirrosis o carcinoma hepatocelular en comparación con la monoinfección por VHB3,4,5.

Actualmente es difícil estimar con precisión la prevalencia del VHD en todo el mundo; al menos entre 12 y 15 millones de personas pueden estar infectadas con el virus, distribuidas en África, Asia, América, el Mediterráneo oriental y Europa6,7. En América del Sur, el área endémica del VHD se ubica en el norte (región de la cuenca del Amazonas) y abarca varios países5,8,9,10. En Brasil, entre 2000 y 2021, el número de casos notificados fue de 4.259. Estas cifras pueden considerarse subregistradas ya que esta enfermedad sigue desatendida en todo el país y no existe una búsqueda activa de pacientes monoinfectados por VHB para determinar coinfecciones11.

El diagnóstico serológico de la infección por VHD se basa en la detección de anticuerpos anti-VHD totales en el suero. La presencia de HDAg en el tejido hepático también es un indicador clínico que permite confirmar la infección mediante elastografía hepática, método no invasivo e indoloro que permite evaluar el grado de fibrosis hepática4,12. Una vez que se detectan los anticuerpos anti-VHD, se utiliza el diagnóstico molecular para confirmar o descartar una infección activa. La prueba molecular se realiza mediante la búsqueda de ARN del VHD en plasma, cuantificado mediante el método RT-qPCR; sin embargo, esto no es convencional ya que no existen kits registrados en la Agencia Brasileña de Vigilancia Sanitaria (Anvisa). El uso de métodos moleculares para cuantificar el VHD en áreas restringidas donde profesionales especializados pueden desarrollar pruebas internas también es un factor limitante13.

Por lo tanto, el diagnóstico molecular del VHD sigue siendo un desafío porque no está ampliamente disponible para las áreas endémicas de la región amazónica. El objetivo del estudio fue desarrollar un ensayo de RT-qPCR cuantitativa múltiple de un paso de alta sensibilidad para el diagnóstico y seguimiento de pacientes con hepatitis Delta.

El plásmido fue probado en intervalos de 1 × 105 y 1,25 copias por reacción (1 × 105, 1 × 104, 1 × 103, 1 × 102, 1 × 101, 5, 2,5 y 1,25), para determinar la eficiencia de amplificación y la linealidad. Todos los puntos de la curva de cuantificación por encima de 5 copias por reacción tuvieron una amplificación del 100% en diferentes ensayos. La pendiente de la prueba cuantitativa inicial fue −3,321 con una eficiencia de 100,04%, coeficiente de correlación de la línea recta (R2) igual a 0,99 y factor de amplificación igual a 2 (ver Fig. 1).

Curva de cuantificación construida a partir de un análisis de regresión lineal de 6 diluciones en serie utilizando un plásmido recombinante que contiene una región parcial de la ribozima HDV, que varía de 5 a 1 × 105 copias por reacción y analizada mediante RT-qPCR; Ct: Umbral del ciclo.

Se evaluaron individual y colectivamente los 3 ensayos realizados con las diluciones estándar, que presentaron un Coeficiente de Variación (CV%) inferior al 10% entre las pruebas (Tabla complementaria S1). Los datos de pendiente, intersección de líneas, eficiencia y correlación entre puntos se describen en la Tabla 1.

Los análisis de los datos de repetibilidad de las diluciones (1 × 105; 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 5; 2,5 y 1,25 copias/reacción) revelaron un límite de cuantificación (LOQ) de 5 copias por reacción ( 250 copias/mL) y Límite de Detección (LOD95%) de 2,83 copias por reacción, equivalente a 142 copias/mL de muestras biológicas (ver Fig. 2), que es el valor de carga viral más bajo que se puede detectar utilizando el ensayo desarrollado. .

El análisis de diluciones replicadas (1 × 105 a 1,25 copias/reacción) reveló un límite de cuantificación (LOQ) de 5 copias por reacción y un límite de detección (LOD95%) de 2,83 copias por reacción para el ensayo desarrollado. Para una visualización más objetiva, los puntos superiores a 1 × 103 no se incluyeron en la figura.

Se recogieron muestras de sangre de 266 pacientes con infección crónica, positivos para anti-VHD, en seguimiento por hepatitis Delta, de los cuales el 16,54% (44/266) fueron identificados con enfermedad hepática y en tratamiento. De este total, el 64,6% (172/266) eran hombres, con edades comprendidas entre 24 y 77 años (media 45 años; desviación estándar (DE) ± 10,23). Las muestras se analizaron utilizando el ensayo desarrollado, donde el 22,93% (61/266) tenía una carga viral cuantificable, en un rango de 2,96 copias por reacción (2,17 Log10 copias/mL) a 9,01 × 105 (7,65 Log10 copias/mL). ) de muestra biológica (ver Fig. 3). Un total del 65,57% (40/61) de las muestras positivas tienen resultados de genotipado para HDV, entre los cuales el 97,5% (39/40) se caracterizan como HDV-3 y el 2,5% (1/40) como HDV-1 (Tabla complementaria S4).

Representación esquemática de la carga viral cuantificada para 266 muestras analizadas mediante RT-qPCR para HDV con valores en copias/mL (Log10) de muestra biológica. La línea discontinua corresponde al límite de detección del ensayo. Los círculos verdes representan muestras positivas en ambas pruebas y los círculos azules representan solo muestras positivas en la prueba desarrollada en este estudio. Las muestras negativas se muestran como cuadrados rojos.

Un total de 11,47% (7/61) de las muestras positivas resultaron negativas para la prueba de referencia14, lo que corresponde al 2,63% (7/266) de las muestras analizadas. En comparación con la prueba de referencia, el ensayo de desarrollo mostró una sensibilidad del 100% (IC 95%: 93,40–100), una especificidad del 96,70% (IC 95%: 93,32–98,66), un valor predictivo positivo del 88,52% (IC 95%: 77,78–95,26) y 100% (IC 95%: 98,22–100) para Valor Predictivo Negativo, con una precisión de 97,37% (IC 95%: 94,65–98,94). La concordancia entre evaluadores cuantificada por el estadístico Kappa (K) fue de 0,92 (IC 95%: 0,86-0,98), lo que muestra una buena fuerza de concordancia entre las pruebas. Se construyó la curva ROC y se calculó que el área bajo la curva (AUC) era 1,00 (Figura complementaria S2). Las muestras divergentes tenían una carga viral de menos de 7 copias por reacción (2,96–6,07 copias/reacción), lo que puede explicar el desacuerdo en los resultados del ensayo y la baja carga viral. Todas las muestras negativas para HDV y positivas para otros virus (DENV, SARS-CoV y HBV monoinfectados, N = 26) mostraron resultados negativos al ser sometidas a la prueba actual.

La hepatitis delta es un problema de salud pública en zonas endémicas de América del Sur. Se trata de una enfermedad desatendida que afecta a poblaciones vulnerables, como los indígenas y ribereños de la cuenca del Amazonas5.

En general, existe una falta global de datos para comprender la epidemiología y las características clínicas. Existen dos formas distintas de transmisión, la denominada coinfección, que se caracteriza por la transmisión simultánea del VHB y el VHD, o incluso la sobreinfección, cuando la transmisión del VHD va precedida de la forma crónica del VHB4,15.

En este estudio, se desarrolló un ensayo para cuantificar diferentes cargas virales de ARN del VHD con alta sensibilidad y eficiencia. La técnica RT-qPCR de un paso desarrollada en el presente estudio mostró buena eficiencia y reproducibilidad, lo cual es significativo para una mayor precisión en la cuantificación a partir de una curva estándar.

La metodología utilizada se basó en procedimientos descritos en la literatura y respeta los estándares cuantitativos internacionales para el diagnóstico molecular, donde el alineamiento de parámetros para la realización de ensayos RT-qPCR es esencial para reducir el riesgo de falsos positivos y resultados no concluyentes, lo que disminuye la confiabilidad del ensayo16. 17. El ensayo cumple con los criterios establecidos para validar una qPCR cuantitativa, como eficiencia, rango dinámico lineal, límite de detección (LOD) y precisión, lo que garantiza su robustez16.

La eficiencia estimada a partir de la pendiente mostró valores cercanos al 100% y un factor de amplificación igual a 2, de acuerdo con lineamientos de estandarización de pruebas que consideran una prueba de alto rendimiento con valores entre 90 y 110%16,18. Asimismo, se determinó el rango dinámico lineal con 5 concentraciones diferentes (Log10), recomendándose un mínimo de 316,19,20, además de la precisión intraensayo (repetibilidad) e interensayo (reproducibilidad) expresada por la Desviación Estándar ( SD) mediciones de réplicas en una curva estándar16,21,22.

El LOD se definió como el valor más bajo probado con 5% de reacciones fallidas, lo que demostró un límite de 142 copias por mL, siendo similar a las 130 copias/mL obtenidas en nuestro estudio anterior; sin embargo, en el ensayo actual, además de agregar un control endógeno para monitorear la calidad de la reacción, el ensayo permite realizar transcripción inversa y qPCR en una sola reacción23. En comparación, otros ensayos para la cuantificación del ARN-VHD mostraron un límite de detección que osciló entre 15 y 750 copias/mL24,25,26.

Durante los experimentos con muestras de pacientes, se observó una mejora en la cuantificación del ARN-HDV al aplicar el paso de choque térmico antes del paso de transcripción inversa. El mismo resultado se observó en un estudio que evaluó el efecto del shock en muestras clínicas diluidas en serie27. Esto podría explicarse por la naturaleza del genoma del HDV, que tiene una alta relación G/C y que hace que el emparejamiento de bases interno sea ~70%2.

En este estudio se optó por utilizar como estándar de cuantificación del ensayo un plásmido recombinante que presentó una secuencia consenso de los 8 genotipos del HDV, teniendo en cuenta que la región amazónica presenta predominio del Genotipo 310,28,29, y el estándar establecido por la OMS para la cuantificación del VHD deriva del genotipo 130. Asimismo, los cebadores utilizados en la estandarización fueron diseñados con el fin de detectar una región conservada para los 8 genotipos del virus, garantizando la sensibilidad y especificidad de la prueba. Es importante señalar que a pesar de su aplicación práctica, el patrón construido con un genoma parcial del HDV tiene sus limitaciones debido a que no se trata de una muestra biológica real, sin embargo, utilizamos el plásmido diluido en una matriz de ácidos nucleicos extraídos de una muestra negativa. HDV para imitar una muestra biológica.

Los resultados de 7 muestras que no estuvieron de acuerdo entre la prueba actual y la prueba de referencia pueden explicarse por los valores límite para la cuantificación; sin embargo, la comparación se limitó solo a los resultados cualitativos porque existen diferentes unidades de medida para la cuantificación. Además, se descarta la posibilidad de posibles falsos positivos por el hecho de que todos los pacientes incluidos en este análisis son positivos en la serología (Anti-HDV). Además, la mayoría de los pacientes de este estudio han recibido terapia para la hepatitis Delta, lo que justifica que a pesar de la serología positiva para HDV, no todos presentaban una carga viral cuantificable, como se observó en ambos ensayos realizados.

En cuanto a la detección del VHD, el diagnóstico se puede realizar tanto mediante la detección de anticuerpos anti-VHD como mediante la búsqueda de marcadores directos, como el antígeno del VHD, y mediante la detección del genoma viral circulante15,31. Una de las principales limitaciones del diagnóstico del VHD por método serológico es la falta de dilucidación de la infección actual, limitándose a un marcador de contacto con el virus, a diferencia de lo que ocurre con el VHB, donde es posible determinar los distintos estadios de la enfermedad. esa enfermedad32. En este caso, el uso de un ensayo cuantitativo puede ayudar a comprender las diferentes etapas de la infección por VHD.

El diagnóstico serológico no se aplica ampliamente en Brasil, lo que dificulta conocer la prevalencia real del VHD en ese país. Es importante generar conciencia y esfuerzos por parte de las autoridades sanitarias y la población sobre la importancia del diagnóstico serológico. De acuerdo con una recomendación de una guía para el Diagnóstico de la Hepatitis Viral en Brasil, la hepatitis Delta debe ser investigada en individuos que presenten resultados reactivos en inmunoensayos para HBsAg y que residan o hayan estado en áreas endémicas para esa condición33.

Según la OMS, todavía existe una limitación en la disponibilidad del diagnóstico del VHD y la ausencia de métodos directos de detección del ARN del VHD, que normalmente se utilizan para monitorear la respuesta a la terapia antiviral34. Al igual que ocurrió con el VHB y el VIH, la estandarización del diagnóstico de laboratorio mediante PCR en tiempo real permitió avances significativos en el protocolo clínico y las pautas terapéuticas para un tratamiento y control adecuado, con abordajes más específicos dirigidos a los pacientes35. La ampliación de la cobertura diagnóstica del VHD en Brasil permitiría la elaboración de directrices para el tratamiento específico y el algoritmo diagnóstico (para identificación en casos sospechosos), reduciendo el riesgo de evolución, con remisión de las actividades hepáticas agudas y crónicas (disminución de las manifestaciones y necroinflamatorias). actividades, cirrosis y carcinoma hepatocelular)36.

En esta primera década, los investigadores todavía abordan cuestiones para establecer un tratamiento satisfactorio para aquellos pacientes infectados por el VHD crónico, a pesar de que la terapia actual con Peg-IFN (interferón pegilado) tiene aproximadamente 35 años de disponibilidad médica32,37. Los obstáculos existentes en relación a la eficacia del tratamiento del VHD están asociados a la dependencia directa de la prescripción de terapias dirigidas al tratamiento del VHB en individuos infectados. Así, el abordaje terapéutico está condicionado a los niveles circulantes de AgHBs, con base en guías internacionales, que orientan el manejo de medicamentos en individuos con VHD sólo cuando, en el seguimiento clínico, presentan una carga viral para VHB > 2.000 UI/mL38,39. . En este caso, la aplicación de un ensayo cuantitativo RT-qPCR para la detección del VHD permitirá identificar, cuantificar y monitorizar la replicación viral durante el curso de la enfermedad en los pacientes.

Además de un diagnóstico molecular serológico y cuantitativo preciso para el VHD, es necesario sensibilizar a las agencias sanitarias y a los gobiernos sobre este tema, con especial atención a los países con un elevado número de casos confirmados. Los programas de vacunación contra el VHB, pero también el mapeo de áreas endémicas del VHD, el seguimiento de los casos y la prestación de tratamiento adecuado a los casos del VHD podrían ser útiles para prevenir la transmisión futura.

En conclusión, este ensayo actual ha demostrado una alta eficiencia y reproducibilidad, lo que lo convierte en una herramienta valiosa para monitorear a los portadores del VHD y evaluar la progresión de la enfermedad, así como la eficacia del tratamiento. Además, este ensayo puede permitir estudios que relacionen los niveles de carga viral y la persistencia del VHD crónico, lo que conlleva un mayor riesgo de desarrollar cirrosis y carcinoma hepatocelular.

Este estudio fue aprobado por el comité de ética en investigación del Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia – CEPEM/RO (Nº 3.826.726), y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Los procedimientos de investigación fueron realizados de acuerdo con los principios éticos estipulados por la Asamblea Médica Mundial de 1975 y el Ministerio de Salud de Brasil y siguen las normas establecidas en la Resolución nº 466, de 12 de diciembre de 2012.

La investigación transversal fue desarrollada en el Laboratorio de Virología Molecular de la Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – FIOCRUZ/RO y en el Centro de Infectología Charles Merieux & Laboratório Rodolphe Merieux (FUNDHACRE). Se recolectaron muestras de sangre de pacientes en el período comprendido entre 2017 y 2023 en el Ambulatório Especializado em Hepatites Virais del CEPEM-RO y en el Serviço de Assistência Especializada (SAE-SESACRE). Se cribaron dos grupos de pacientes: portadores de VHD con diagnóstico previo por ELISA (Positivos a Anti-HDV, HBsAg y Anti-HBc-Total; n = 266); y un segundo grupo infectado por algunos otros virus (n = 26), VHB (16/26), DENV (5/26) y SARS-CoV-2 (5/26) sin evidencia de infección por VHD (Negativo a Anti- HDV). La información de los exámenes clínicos y de laboratorio se recopiló de los registros médicos.

El ácido nucleico se extrajo mediante el método de perlas magnéticas seguido de un extractor automatizado de ADN y ARN EXTRACTA 32 (LOCCUS, São Paulo, Brasil) y un purificador con EXTRACTA KIT FAST – Viral DNA/RNA (MVXA-P016FAST) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluyó en 50 µL de tampón de elución.

Para construir el estándar de cuantificación se seleccionaron secuencias de referencia para los diferentes genotipos del VHD depositados en el Genbank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo ClustalW (Molecular Evolutionary Genetics Analysis – MEGA, Versión 11)40. Después del alineamiento, se construyó una secuencia consenso de 1014 pares de bases (pb) correspondientes a los 8 genotipos. La región seleccionada comprende parcialmente el genoma completo del HDV (posición inicial 675 y final 1682; secuencia de referencia NCBI: NC_001653.2) que comprende las regiones corta, larga, ribozima y región no codificante (NTR) del antígeno viral (HDVAg). El inserto se sintetizó comercialmente y se clonó en el vector pUC57 (Genscript Biotech Corporation, Nueva Jersey, EE. UU.) generando un plásmido recombinante con un tamaño de 3724 pares de bases (Figura complementaria S3).

La concentración de plásmido en ng/μL se determinó mediante fluorimetría utilizando el kit Qubit 4 dsDNA High Sensitivity (ThermoFisher Scientific®, Massachusetts, EE. UU.) y se calculó el número de copias inicial de 2,12 × 108 con base en el tamaño y peso molecular del ADN recombinante, según al método descrito previamente41, basado en la siguiente Ec. (1):

El plásmido recombinante se diluyó en serie en una matriz biológica de ácidos nucleicos extraídos del suero humano negativo para la hepatitis Delta en las siguientes concentraciones, 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 1×100; 0,5 y 0,125 copias por microlitro para amplificar simultáneamente la diana viral (HDV) y el control endógeno humano (RNasa P).

Para cuantificar el ARN-HDV, se diseñaron cebadores y sondas para detectar la región ribozima, que está altamente conservada42, como se ve en la Figura complementaria S3. Para alterar las estructuras secundarias del genoma del VHD, el material genético extraído de muestras biológicas se incubó a 95 °C durante 5 minutos y luego en hielo durante 1 minuto. La reacción multiplex se estandarizó utilizando 5 µL de TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems®, California, EE. UU.), 10 µL de cada dilución de curva o material genético de muestra biológica, 5 µL de oligomix que contiene 300 nM de cada cebador. y 100 nM para la sonda HDV, y 500 nM de cada cebador y 125 nM de sonda para la detección del Control Endógeno (Tabla 2).

La reacción se realizó en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 7 Pro en las siguientes condiciones: 50 °C durante 30 min para transcripción inversa y 95 °C durante 15 min para activación de PCR, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 63 °C durante 30 s, donde se capturó la fluorescencia. Los datos se analizaron en la versión de análisis y diseño de software: 2.6.0 utilizando una línea de base de 3 a 15 y un umbral de 0,1 para ambos objetivos.

La reproducibilidad y repetibilidad se midieron mediante 3 pruebas realizadas en días consecutivos por diferentes operadores. Los puntos con 1×105; 1 × 104; 1 × 103; 1 × 102; 1 × 101; 5; Se utilizaron 2,5 y 1,25 copias/reacción en octuplicados técnicos para cada día. La sensibilidad analítica se determinó utilizando datos de repetibilidad, que sirvieron como base para medir el límite de detección (LOD95%).

Para determinar la sensibilidad diagnóstica, las muestras biológicas se sometieron a pruebas desarrolladas para la cuantificación del ARN del VHD. Todas las muestras analizadas se sometieron a una segunda prueba RT-qPCR cuantitativa comercial (RealStar® HDV RT-PCR Kit 1.0; Altona Diagnostics, Hamburgo, Alemania) como referencia14 y se compararon con los datos obtenidos. Las muestras positivas para otros virus y negativas para HDV (DENV, SARS-CoV y HBV monoinfectados) se analizaron utilizando el ensayo desarrollado para estimar la especificidad diagnóstica.

Los análisis descriptivos se representaron mediante frecuencias, tendencia central y dispersión. La Curva Estándar se realizó utilizando el software R v4.2.144 y para calcular el Límite de Detección (LOD95%), los datos de sensibilidad analítica se sometieron a un análisis de regresión binomial utilizando el modelo estadístico Probit. Los resultados de sensibilidad y especificidad diagnóstica fueron utilizados para estimar los valores de sensibilidad, especificidad, Valor Predictivo Positivo, Valor Predictivo Negativo, Índice de Acuerdo Kappa y construcción de la curva ROC, utilizando ensayo de referencia14.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Este estudio fue desarrollado por el grupo de investigadores del Laboratorio de Virología Molecular de la Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – FIOCRUZ/RO junto con el Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia—CEPEM/RO, la Secretaria de Estado da Saúde de Rondônia—SESAU /RO, Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de Epidemiología de la Amazonía Occidental – INCT/EpiAmo, y Fundación Rondônia de Apoyo al Desarrollo de Acciones e Investigaciones Científicas y Tecnológicas en el Estado de Rondônia – FAPERO (Proceso: VPPIS-003-FIO - 20-2-75; INNOVACIÓN EN LA AMAZONIA). Colaboraron el Servicio de Asistencia Especializada (SAE-SESACRE), la Fundação Estadual Hospitalar do Acre (FUNDHACRE), la Fundação Maria Emília, la Fondation Merieux, la Coordinación de Superación Personal de la Educación Superior – CAPES y la Coordinación de Vigilancia de la Salud y Laboratorios de Referencia – CVSLR/FIOCRUZ. imprescindible para el desarrollo del estudio.

Estos autores contribuyeron por igual: Jackson Alves da Silva Queiroz y Tárcio Peixoto Roca.

Fundação Oswaldo Cruz Rondônia FIOCRUZ/RO, Rua da Beira, 7176, Porto Velho, 76812-245, Brasil

Jackson Alves da Silva Queiroz, Tárcio Peixoto Roca, Ana Maísa Passos-Silva, André Luiz Ferreira da Silva, Soraya dos Santos Pereira & Deusilene Vieira

Programa de Postgrado en Biología Experimental, Universidad Federal de Rondônia y Fundação Oswaldo Cruz Rondônia – UNIR/FIOCRUZ/RO, 76801-974, Porto Velho, Brasil

Jackson Alves da Silva Queiroz, Ana Maísa Passos-Silva, André Luiz Ferreira da Silva, Soraya dos Santos Pereira & Deusilene Vieira

Programa de Postgrado en Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz/IOC, FIOCRUZ, 21041-250, Río de Janeiro, Brasil

Tárcio Peixoto Roca, Luiz Fellype Alves de Souza, Eugênia de Castro e Silva & Lívia Melo Villar

Centro de Infectología Charles Merieux y Laboratorio Rodolphe Merieux (FUNDHACRE), Rio Branco, 69918-340, Brasil

Rutilene Barbosa Souza, Luiz Fellype Alves de Souza y Daniel Arquímedes da Matta

Universidad Federal de Bahía – UFBA, Salvador, 40110-909, Brasil

Rutileno Barbosa Souza

Centro de Investigaciones en Medicina Tropical – CEPEM, Porto Velho, 76812-329, Brasil

Eugênia de Castro e Silva y Lourdes Maria Pinheiro Borzacov

Instituto de Biología Molecular de Paraná - IBMP, 81350-010, Curitiba, Brasil

Rita de Cássia Pontello Rampazzo

Universidad Federal de Acre – UFCC, Rio Branco, 69915-900, Brasil

Thor Oliveira Dantas

Laboratorio Central de Salud Pública de Acre – LACEN/AC, Rio Branco, 69900-614, Brasil

Janaína Mazaro

Universidad Federal de Rondônia - UNIR, Porto Velho, 76801-974, Brasil

Juan Miguel Villalobos Salcedo

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Conceptualización: JASQ, TPR, DV; Ensayos moleculares: JASQ, TPR, RBS, LFAS; Selección de muestras de datos de panel: JASQ, TPR, RBS, LFAS; Enfoque médico: ECS, LMPB, TOD, JMVS; Curación de datos: JASQ, TPR; Análisis formal: JASQ, TPR; Adquisición de financiación: JMVS, DV, DAM; Investigación: JASQ, TPR, RBS; Metodología: JASQ, TPR, RCPR, SSP, JM, LMV; Administración de Proyectos: DV; Supervisión: DV; Redacción: borrador original: JASQ, TPR, RBS, LFAS, AMPS, ALFS, SSP; Redacción, revisión y edición: RCPR, DAM, DV Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Deusilene Vieira.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

da Silva Queiroz, JA, Roca, TP, Souza, RB et al. Desarrollo de un ensayo cuantitativo de un solo paso de RT-qPCR multiplex para la detección del virus de la hepatitis delta. Representante científico 13, 12073 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37756-z

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Recibido: 17 de abril de 2023

Aceptado: 27 de junio de 2023

Publicado: 26 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37756-z

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